İnvazif aspergilloz oluşturulan sıçanlarda glukan ve galaktomannan testleri ile gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu sonuçlarının karşılaştırılması

KUŞTİMUR, Semra; Kalkanci, Ayse; AYDOĞAN, SİBEL

İnvazif aspergilloz oluşturulan sıçanlarda glukan ve galaktomannan testleri ile gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu sonuçlarının karşılaştırılması

Sibel AYDOĞAN, (Hacettepe Üniversitesi, Tıp Fakültesi, Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, Ankara, Türkiye)

Semra KUŞTİMUR, (Gazi Üniversitesi, Tıp Fakültesi, Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, Ankara, Türkiye)

Ayşe KALKANCI (Gazi Üniversitesi, Tıp Fakültesi, Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, Ankara, Türkiye)

Mikrobiyoloji Bülteni

4 0

Yıl: 2010 Cilt: 44 Sayı: 3 Sayfa Aralığı: 441 - 452 Metin Dili: Türkçe İndeks Tarihi: 29-07-2022

İnvazif aspergilloz oluşturulan sıçanlarda glukan ve galaktomannan testleri ile gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu sonuçlarının karşılaştırılması

Öz:

Günümüzde, Aspergillus türleri tarafından oluşturulan enfeksiyonların görülme sıklığı ve mortalitesi giderek artmakta olup, özellikle immün sistemi baskılanmış ve nötropenik hastalarda invazif aspergilloz (İA) başlıca ölüm sebeplerinden biridir. Bu nedenle, erken ve doğru tanı İA’lı hastalar için hayat kurtarıcı olabilir. Bu çalışmada, deneysel olarak akciğer aspergillozu geliştirilen nötropenik sıçan modelinde, kültür, gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (RtPCR), galaktomannan (GM) ve glukan (GC) test sonuçlarının karşılaştırılması ve erken tanıya olan katkılarının değerlendirilmesi amaçlanmıştır. Hayvan Araş- tırmaları Etik Kurulu onayı ile gerçekleştirilen çalışmada, dişi Wistar albino sıçanları, sağlıklı kontrol grubu (n= 6), nötropeni kontrol grubu (n= 10) ve akciğer aspergilloz grubu (n= 35) olacak şekilde üç gruba ayrılmıştır. Sıçanlarda nötropeni, 5-florourasil kullanılarak oluşturulmuş ve Aspergillus fumigatus konidyumları burundan inokülasyon yoluyla verilmiştir. Enfeksiyonun yedinci gününde hayvanların kan, bronkoalveoler lavaj (BAL) ve akciğer doku örnekleri alınmış ve kontrol grupları ile aspergilloz grubunun enfeksiyon göstergeleri karşılaştırılmıştır. Kontrol grubunda bütün test sonuçları (kültür, PCR, GM ve GC testleri) negatif bulunmuştur. Aspergilloz grubunda, deney sonunda sağ kalan 22 denekten alınan akciğer doku örneklerinin tümünün patolojik preparatlarında hifler görülmüş; 20 (%91)’sinin kültüründe Aspergillukolonileri üretilmiştir. Aspergilloz grubundan alınan 12 BAL örneğinin 7 (%58.3)’sinde, 19 kan örneğinin 7 (%36.8)’sinde ve 22 akciğer doku örneğinin 4 (%18)’ünde Aspergillus DNA’sı RtPCR ile gösterilmiştir. Bu grupta GM antijeni, ticari bir kit (Platelia® Aspergillus ELISA; BioRad, Fransa) kullanılarak 20 serum örneğinin 7 (%35)’sinde; GC antijeni ise ticari, kantitatif bir kit kullanılarak (Fungitell™; Cape Cod, ABD) 22 serum örneğinin 11 (%50)’inde ve 17 BAL örneğinin 9 (%52.9)’unda gösterilmiştir. Çalışmamızda,kültür referans yöntem olarak alındığında, BAL örneklerine uygulanan PCR testinin diğer yöntemlere göre daha yüksek duyarlılığa sahip olduğu (BAL-PCR %58.3; kan-PCR %41.2; doku-PCR %20; serum GM %38.9; serum GC %55; BAL-GC %52.9) ve serumda GC aranmasının GM aranmasından daha değerli olduğu (serum-GM için duyarlılık %38.9, serum-GC için duyarlılık %55; her ikisi için özgüllük %100) kanısına varılmıştır. Doğrulanmış olguların BAL örneklerinin, kan örneklerinden daha doğru sonuç verdiği görülmüştür. Buna karşın, histopatolojik olarak doğrulanmış olguların bile BAL örneklerinin %41.7’sinde PCR ile, serum örneklerinin %50’sinde GC testi ile ve yine serum örneklerinin %65’inde GM testi ile negatif sonuç alınmıştır. Sonuç olarak, İA patogenezinin tam olarak anlaşılamamış olması kültür dışı tanısal testlerin performansını etkilediğinden, gelecekte yapılacak çalışmalar, kültür dışı farklı tanı yöntemlerinin performanslarının ve birlikte kullanımlarının değerlendirilmesi konusunda olmalıdır.

Anahtar Kelime:

Konular: Mikrobiyoloji Hematoloji Biyoteknoloji ve Uygulamalı Mikrobiyoloji Enfeksiyon Hastalıkları

Comparison of glucan and galactomannan tests with real-time pcr for diagnosis of invasive aspergillosis in a neutropenic rat model

Öz:

The incidence of aspergillosis which has high mortality rates, has increased gradually. Since invasive aspergillosis (IA) is one of the leading causes of death in immunocompromized and neutropenic patients, early and accurate diagnosis of IA is of crucial importance. The aims of this study were to compare the results of culture, real-time polymerase chain reaction (RtPCR), galactomannan (GM) antigen and glucan (GC) antigen detection tests and to evaluate their performances in view of rapid and accurate diagnosis of IA in neutropenic rat model. Female Wistar albino rats were included in the study with the consent of Animal Searching Ethical Committee and classified into three groups as healthy controls (n= 6), neutropenic controls (n= 10) and pulmonary aspergillosis (n= 35) groups. Rats were immunosuppressed with 5-flourourasil and then Aspergillus fumigatus conidia were inoculated intranasally. On the seventh day of the infection, blood, bronchoalveolar lavage (BAL) and lung tissue samples were collected from the animals, and control and aspergillosis groups were compared in terms of infection markers. All of the tests (culture, RtPCR, GM and BG tests) were found to be negative in controls. At the end of the study 22 rats in aspergillosis group survived. Lung tissue samples from those 22 animals were all positive for the presence of hypha on pathological preparations, while 20 (91%) yielded Aspergillus colonies on the cultures. Aspergillus DNA was detected in 7 of the 12 BAL samples (58.3%), 7 of 19 blood samples (36.8%) and 4 of 22 lung tissue samples (18%) using RtPCR method. GM antigen was detected in 7 of 20 serum samples (35%) with a commercial kit (Platelia® Aspergillus ELISA, BioRad, France). Quantitative detection of beta-glucan levels were investigated by using a commercial kit (Fungitell™, Cape Cod, USA) in serum and BAL samples and positive results were obtained in 11 of 22 se- rum (50%) and 9 of 17 BAL (52.9%) samples. In this study it was demonstrated that PCR performed in BAL samples is the most sensitive method compared to the others, for the diagnosis of IA in the rat model. The sensitivity rates were as follows when culture method accepted as the gold standard: 58.3% for BAL-PCR, 41.2% for blood-PCR, 20% for tissue-PCR, 38.9% for serum GM, 55% for serum GC and 52.9% for BAL-GC. It was also concluded that detection of GC activity in serum was more sensitive than GM detection in serum (sensitivity of GM was %38.9, sensitivity of GC was %55, while specificities were 100% for both of the tests), for laboratory diagnosis of IA. The BAL samples were evaluated as the most valuable clinical samples to screen the suspected patients. However, even in proven cases, 41.7% of BAL samples were found negative with PCR, 50% of serum samples were found negative with GC test, and 65% of serum samples were found negative with GM test. Since the pathogenesis of IA has not been completely clarified, the performance of non-culture based diagnostic tests exhibit great variability. Future clinical studies are required to compare the performance of different non-culture based diagnostic methods and the optimal combination of these tests for the most accurate laboratory diagnosis of IA.

Anahtar Kelime:

Konular: Mikrobiyoloji Hematoloji Biyoteknoloji ve Uygulamalı Mikrobiyoloji Enfeksiyon Hastalıkları

Belge Türü: Makale Makale Türü: Araştırma Makalesi Erişim Türü: Bibliyografik

1. Kauffman CA. The changing landscape of invasive fungal infections: epidemiology, diagnosis and pharma- cologic options. Clin Infect Dis 2006; 43: S1-2.
2. Maschmeyer G. The changing epidemiology of invasive fungal infections: new threats. Int J Antimicrob Agents 2006; 27(Suppl 1): 3-6.
3. Pfaller MA, Pappas PG, Wingard JR. Invasive fungal pathogens: current epidemiological trends. Clin Infect Dis 2006; 43: S3-14.
4. Richardson MD, Kokki M. Aspergillus, pp: 273-96. In: Anaissie EJ, McGinnis MR, Pfaller MA (eds), Clinical Mycology. 2003. Churchill Livingston, New York.
5. Alexander BD, Pfaller MA. Contemporary tools for the diagnosis and management of invasive mycoses. Clin Infect Dis 2006; 43: S15-27.
6. Preuner S, Lion T. Towards molecular diagnostics of invasive fungal infections. Expert Rev Mol Diagn 2009; 9: 397-401.
7. Alexander BD. Diagnosis of fungal infection: new technologies for the mycology laboratory. Transplan Infect Dis 2002; 4 (Suppl 3): 32-7.
8. Chamilos G, Kontoyiannis DP. Defining the diagnosis of invasive aspergillosis. Med Mycol 2006; 44: S163-172.
9. McLintock LA, Jones BL. Advances in the molecular and serological diagnosis of invasive fungal infection in haemato-oncology patients. Br J Haematol 2004; 126: 289-97.
10. De Pauw B, Walsh TJ, Donnelly JP, et al. European Organization for Research and Treatment of Cancer/Invasive Fungal Infections Cooperative Group; National Institute of Allergy and Infectious Diseases Mycoses Study Group (EORTC/MCG) Consensus Group. Revised definitions of invasive fungal disease from the European Organization for Research and Treatment of Cancer/Invasive Fungal Infections Cooperative Group and the National Institute of Allergy and Infectious Diseases Mycoses Study Group (EORTC/MSG) Consen- sus Group. Clin Infect Dis 2008; 46: 1813-21.
11. Hizel K, Kokturk N, Kalkanci A, Ozturk C, Kustimur S, Tufan M. Polymerase chain reaction in the diagnosis of invasive aspergillosis. Mycoses 2004; 47: 338-42.
12. Saraçlı MA. Aspergilloz tanısında moleküler yöntemler, s: 195-201. Ener B (ed), Aspergillus. Türk Mikrobiyoloji Cemiyeti Yayını 2006, No: 56, İstanbul.
13. Sheppard DC, Marr KA, Fredricks DN, Chiang LY, Doedt T, Filler SG. Comparison of three methodologies for the determination of pulmonary fungal burden in experimental murine aspergillosis. Clin Microbiol Infect 2006; 12: 376-80.
14. Balloy V, Huerre M, Latge JP, Chignard M. Differences in patterns of infection and inflammation for corticosteroid treatment and chemotherapy in experimental invasive pulmonary aspergillosis. Infect Immun 2005; 73: 494-503.
15. Latge JP. Aspergillus fumigatus and aspergillosis. Clin Microbiol Rev 1999; 12: 310-50.
16. Steinbach WJ, Benjamin DK, Trasi SA, et al. Value of an inhalational model of invasive aspergillosis. Med Mycol 2004; 42: 417-25.
17. Buchheidt D, Hummel M. Aspergillus polymerase chain reaction (PCR) diagnosis. Med Mycol 2005; 43:S139-45.
18. Khan ZU, Ahmad S, Theyyathel AM. Detection of Aspergillus fumigatus-specific DNA, (1-3)-β-D-glucan and galactomannan in serum and bronchoalveolar lavage specimens of experimentally infected rats. Mycoses 2008; 51: 129-35.
19. Kami M, Fukuti T, Ogawa S. Use of real-time PCR on blood samples for diagnosis of invasive aspergillosis. Clin Infect Dis 2001; 33: 1504-12.
20. Pazos C, Ponton J, Palacio AD. Contribution of (1→3)-beta-D-Glucan chromogenic assay to diagnosis and therapeutic monitoring of invasive aspergillosis in neutropenic adult patients: a comparison with serial screening for circulating galactomannan. J Clin Microbiol 2005; 43: 299-305.
21. Obayashi T, Yoshida M, Mori T, et al. Plasma (1→3) beta-D-glucan measurement in diagnosis of invasive deep mycosis and fungal febril episodes. Lancet 1995; 345: 17-20.
22. Odabasi Z, Mattiuzzi G, Estey E, et al. beta-D-Glucan as a diagnostic adjunct for invasive fungal infections: validation, cutoff development, and performance in patients with acute myelogenous leukemia and myelodysplastic syndrome. Clin Infect Dis 2004; 39: 199-205.
23. Hebart H, Loeffler J, Meisner C, et al. Early detection of Aspergillus infection after allogeneic stem cell transplantation by polymerase chain reaction screening. J Infect Dis 2000; 181: 1713-9.
24. White PL, Barnes RA. Aspergillus PCR-Platforms, strengths and weaknesses. Med Mycol 2006; 44: 191-8.
25. Bolehovska R, Pliskova L, Buchta V, Cerman J, Hamal P. Detection of Aspergillus spp. in biological samples by real-time PCR. Biomed Pap Med Fac Univ Palacky Olomouc Czech Repub 2006; 150: 245-8.
26. Loeffler J, Kloepfer K, Hebart H, et al. Polymerase chain reaction detection of Aspergillus DNA in experimen- tal models of invasive aspergillosis. J Infect Dis 2002; 185: 1203-6.
27. Creger RJ, Weeman KE, Jacobs MR, et al. Lack of utility of the LysiCentrifugation blood culture method for detection of fungemia in immunocompromised cancer patients. J Clin Microbiol 1998; 36: 290-3.
28. Kawazu M, Kanda Y, Nannya Y, et al. Prospective comparison of the diagnostic potential of real-time PCR, double-sandwich enzyme-linked immunosorbent assay for galactomannan, and a (1→3)-beta-D-Glucan test in weekly screening for invasive aspergillosis in patients with hematological disorders. J Clin Microbiol 2004; 42: 2733-41.
29. Scotter JM, Chambers ST. Comparison of galactomannan detection, PCR-Enzyme-linked immunosorbent assay, and real-time PCR for diagnosis of invasive aspergillosis in a neutropenic rat model and effect of caspofungin acetate. Clin Diag Lab Immunol 2005; 12: 1322-7.

APA	AYDOĞAN S, KUŞTİMUR S, Kalkanci A (2010). İnvazif aspergilloz oluşturulan sıçanlarda glukan ve galaktomannan testleri ile gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu sonuçlarının karşılaştırılması. , 441 - 452.
Chicago	AYDOĞAN SİBEL,KUŞTİMUR Semra,Kalkanci Ayse İnvazif aspergilloz oluşturulan sıçanlarda glukan ve galaktomannan testleri ile gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu sonuçlarının karşılaştırılması. (2010): 441 - 452.
MLA	AYDOĞAN SİBEL,KUŞTİMUR Semra,Kalkanci Ayse İnvazif aspergilloz oluşturulan sıçanlarda glukan ve galaktomannan testleri ile gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu sonuçlarının karşılaştırılması. , 2010, ss.441 - 452.
AMA	AYDOĞAN S,KUŞTİMUR S,Kalkanci A İnvazif aspergilloz oluşturulan sıçanlarda glukan ve galaktomannan testleri ile gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu sonuçlarının karşılaştırılması. . 2010; 441 - 452.
Vancouver	AYDOĞAN S,KUŞTİMUR S,Kalkanci A İnvazif aspergilloz oluşturulan sıçanlarda glukan ve galaktomannan testleri ile gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu sonuçlarının karşılaştırılması. . 2010; 441 - 452.
IEEE	AYDOĞAN S,KUŞTİMUR S,Kalkanci A "İnvazif aspergilloz oluşturulan sıçanlarda glukan ve galaktomannan testleri ile gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu sonuçlarının karşılaştırılması." , ss.441 - 452, 2010.
ISNAD	AYDOĞAN, SİBEL vd. "İnvazif aspergilloz oluşturulan sıçanlarda glukan ve galaktomannan testleri ile gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu sonuçlarının karşılaştırılması". (2010), 441-452.

APA	AYDOĞAN S, KUŞTİMUR S, Kalkanci A (2010). İnvazif aspergilloz oluşturulan sıçanlarda glukan ve galaktomannan testleri ile gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu sonuçlarının karşılaştırılması. Mikrobiyoloji Bülteni, 44(3), 441 - 452.
Chicago	AYDOĞAN SİBEL,KUŞTİMUR Semra,Kalkanci Ayse İnvazif aspergilloz oluşturulan sıçanlarda glukan ve galaktomannan testleri ile gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu sonuçlarının karşılaştırılması. Mikrobiyoloji Bülteni 44, no.3 (2010): 441 - 452.
MLA	AYDOĞAN SİBEL,KUŞTİMUR Semra,Kalkanci Ayse İnvazif aspergilloz oluşturulan sıçanlarda glukan ve galaktomannan testleri ile gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu sonuçlarının karşılaştırılması. Mikrobiyoloji Bülteni, vol.44, no.3, 2010, ss.441 - 452.
AMA	AYDOĞAN S,KUŞTİMUR S,Kalkanci A İnvazif aspergilloz oluşturulan sıçanlarda glukan ve galaktomannan testleri ile gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu sonuçlarının karşılaştırılması. Mikrobiyoloji Bülteni. 2010; 44(3): 441 - 452.
Vancouver	AYDOĞAN S,KUŞTİMUR S,Kalkanci A İnvazif aspergilloz oluşturulan sıçanlarda glukan ve galaktomannan testleri ile gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu sonuçlarının karşılaştırılması. Mikrobiyoloji Bülteni. 2010; 44(3): 441 - 452.
IEEE	AYDOĞAN S,KUŞTİMUR S,Kalkanci A "İnvazif aspergilloz oluşturulan sıçanlarda glukan ve galaktomannan testleri ile gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu sonuçlarının karşılaştırılması." Mikrobiyoloji Bülteni, 44, ss.441 - 452, 2010.
ISNAD	AYDOĞAN, SİBEL vd. "İnvazif aspergilloz oluşturulan sıçanlarda glukan ve galaktomannan testleri ile gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu sonuçlarının karşılaştırılması". Mikrobiyoloji Bülteni 44/3 (2010), 441-452.