Kanser Kökenli Hücre Dizilerinde İnfluenza Virüsünün İndüklediği Otofaji Belirteçleri ile MUC1 Ekspresyonu Arasındaki İlişkinin Araştırılması

Özkan, Hasan Selçuk; Özarslan, Muhammed Alper; Vatansever, Gokhan; Durmaz, Seyfi; Cicek, Candan

doi:10.5578/mb.20239932

Kanser Kökenli Hücre Dizilerinde İnfluenza Virüsünün İndüklediği Otofaji Belirteçleri ile MUC1 Ekspresyonu Arasındaki İlişkinin Araştırılması

Hasan Selçuk ÖZKAN, (Ege Üniversitesi, Tıp Fakültesi, İzmir, Türkiye)

Alper ÖZARSLAN, (Ege Üniversitesi, Tıp Fakültesi, Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, İzmir, Türkiye)

Gökhan VATANSEVER, (Ege Üniversitesi, Tıp Fakültesi, Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, İzmir, Türkiye)

Seyfi DURMAZ, (Ege Üniversitesi, Tıp Fakültesi, Çalışan Sağlığı ve Güvenliği Birim, İzmir, Türkiye)

Candan ÇİÇEK (Ege Üniversitesi, Tıp Fakültesi, Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, İzmir, Türkiye)

Mikrobiyoloji Bülteni

5 0

Yıl: 2023 Cilt: 57 Sayı: 3 Sayfa Aralığı: 390 - 400 Metin Dili: Türkçe DOI: 10.5578/mb.20239932 İndeks Tarihi: 05-09-2023

Kanser Kökenli Hücre Dizilerinde İnfluenza Virüsünün İndüklediği Otofaji Belirteçleri ile MUC1 Ekspresyonu Arasındaki İlişkinin Araştırılması

Öz:

İnfluenza virüsüne bağlı gelişen otofajiye sıklıkla apoptoz eşlik eder ve virüs ile enfekte olan hücrelerde, hücre ölümüyle sonuçlanır. Otofajinin, enerji kaynaklarının ve dış uyarıcıların varlığına yanıtta önemli rol oynayan mTOR/PI3K/Akt yolağı tarafından modüle edildiği iyi bilinmektedir. Bu yol, hücre dışı ve hücre içi bileşenlere sahip olan ve metastaz ile kemoterapötik dirençte önemli bir rol oynayan müsin 1 (MUC1) tarafından modüle edilmektedir. Bu çalışmada, influenza virüsünün hücreye inokülasyonundan sonra MUC1’in eksprese olması ve buna bağlı olarak kanserli hücrelerde mTOR ve LC3B gibi otofaji belirteçlerindeki değişiklikleri gözlemlemek amaçlanmıştır. Bu çalışmada, adenokarsinom özelliğine sahip MCF-7, He-La ve A-549 hücre dizileri kullanılmıştır. Bu hücrelerde influenza virüs üremesini kontrol etmek için ise MDCK hücre dizisine ayrıca ekim yapılmıştır. Tüm deneylerde santrifüj ile güçlendirilmiş “shell vial” hücre kültürü yöntemi kullanılmıştır. Bu hücre dizilerine influenza A (H1N1) pdm09 suşu inoküle edilip, 48 saatlik inkübasyon süresi sonunda tüm hücrelerin süpernatanlarından alınan örneklerde kantitatif gerçek zamanlı revers transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu [quantitative real-time reverse transcriptase polymerase chain reaction (qRT-PCR)] yöntemiyle viral RNA düzeyinin yanı sıra, MUC1, mTOR ve LC3B ilişkili genlerin ‘cycle threshold (Ct)’ değerleri de araştırılmıştır. Bu yapıların hücrelerde bulunup bulunmadıklarını araştırmak için ayrıca, hücrelerin tümü paraformaldehit ile geçirgenleştirildikten sonra, enfekte hücrelerle kaplı lameller MUC1, mTOR, LC3B ve influenza virüs antijenlerine karşı geliştirilmiş floresanla işaretli monoklonal antikorlarla boyanmıştır. İnfluenza virüs ekimi yapılan MCF-7, He-La, A-549 hücre dizilerinde; LC3B, mTOR ve MUC1 monoklonal antikor boyamaları sonucunda floresans veren hücreler saptanmıştır. İnfluenza virüs ekimi yapılmayan tüm hücre dizilerinde (MCF-7, He-La ve A-549) ise tüm boyamalar negatif bulunmuştur. İnfluenza virüsü inoküle edilen A-549 hücre dizisinde MUC1, LC3B ve mTOR ilişkili genlerin Ct değerleri daha düşük saptanmıştır. MCF-7 ve He-La hücre dizilerindeyse protein ekspresyonu gösterilmesine karşın otofaji yolağındaki genlerin 1/Ct değerlerinde bu yönde bir değişiklik saptanmamıştır. Sadece MCF-7 hücre dizisinde MUC1 ilişkili genin inokülasyon sonrası Ct değeri daha yüksek saptanmıştır. Sonuç olarak; adenokarsinom yapısındaki hücreler içinde sadece A-549 hücre dizisinde influenza virüsü kaynaklı otofaji için özgül ekspresyon paterninin oluştuğu gözlenmiştir. Bu ilişkinin, akciğer adenokarsinomu konusundaki ileri araştırmalarda bir veri oluşturabileceği düşünülmüştür. Ancak bu öngörülerin, gelecekte yapılacak olan çalışmalarda bu genlerin protein seviyesindeki ekspresyonlarının daha ileri testler kullanılarak tespit edilmesi, daha iyi karşılaştırma sonuçlarının elde edilmesini sağlayacaktır.

Anahtar Kelime: Otofaji belirteçleri influenza virüsü müsin 1

Autophagy Markers Induced by Influenza Virus and MUC1 Expressions in Cancer-Derived Cell Lines

Öz:

Influenza virus-induced autophagy is often accompanied by apoptosis and results in cell death in virus-infected cells. It is well known that autophagy is modulated by the mTOR/PI3K/Akt pathway, which plays an important role in the response to the presence of energy sources and external stimuli. This path- way is modulated by mucin 1 (MUC1), which has extracellular and intracellular components and plays an important role in metastasis and chemotherapeutic resistance. In this study, it was aimed to investigate the expression of MUC1 after the inoculation of influenza viruses into the cancer-derived cell cultures and, accordingly, the changes in autophagy markers such as mTOR and LC3B. In this study, MCF-7, He- La and A-549 cell lines were used which have adenocarcinoma origin. To control the growth of influenza virus in these cells, the MDCK cell line was also inoculated. Centrifuge-enhanced shell-vial cell culture method was used in all experiments. Influenza A (H1N1) pdm09 strain was inoculated into these cell lines then the expressions of viral nucleic acid and cycle threshold (Ct) of MUC1, mTOR, LC3B associated genes were investigated by quantitative real-time reverse transcriptase polymerase chain reaction (qRT- PCR) method in the samples taken from the supernatants of all cells at the end of the 48-hour incubation period. To investigate whether these markers were present in cells, after all cells were permeabilized with paraformaldehyde, cell-coated infected coverslips were stained with fluorescent labeled monoclonal antibodies developed against MUC1, mTOR, LC3B and influenza virus antigens. In the examination of fluorescence microscopy, all of the cell cultures (MCF-7, He-La and A-549) infected with influenza virus yielded positive results in terms of LC3B, mTOR and MUC1 monoclonal antibody staining, whereas all of the non-infected cells were found negative. Cycle threshold values of MUC1, LC3B and mTOR associated genes were found to be lower in A-549 cell line inoculated with influenza virus. Although protein ex- pression was demonstrated in MCF-7 and He-La cell lines, similar changes were not detected in the 1/Ct values of genes in the autophagy pathway. The Ct value of the MUC1 gene was found to be higher only in the MCF-7 cell line after inoculation. In conclusion, it was observed that the specific expression pattern for influenza virus-induced autophagy was formed only in the A-549 cell line among the adenocarcinoma cells. It was thought that this relationship could constitute a dataset in further research on lung adeno- carcinoma. However, in future studies, the determination of the expression of these genes at the protein level by using further tests will provide better comparison of the results.

Anahtar Kelime: Autophagy markers influenza virus mucin 1

Belge Türü: Makale Makale Türü: Araştırma Makalesi Erişim Türü: Bibliyografik

1. Saxton RA, Sabatini DM. mTOR Signaling in growth, metabolism, and disease. Cell 2017; 168(6): 960-76. https://doi.org/10.1016/j.cell.2017.02.004
2. Yeganeh B, Ghavami S, Rahim MN, Klonisch T, Halayko AJ, Coombs KM. Autophagy activation is required for influenza A virus-induced apoptosis and replication. Biochim Biophys Acta Mol Cell Res 2018; 1865(2): 364-78. https://doi.org/10.1016/j.bbamcr.2017.10.014
3. Yu JSL, Cui W. Proliferation, survival and metabolism: The role of PI3K/AKT/ mTOR signalling in pluripotency and cell fate determination. Dev 2016; 143(17): 3050-60. https://doi.org/10.1242/dev.137075
4. He HY, Ren L, Guo T, Deng YH. Neuronal autophagy aggravates microglial inflammatory injury by downregulating CX3CL1/fractalkine after ischemic stroke. Neural Regen Res 2019; 14(2): 280-8. https://doi. org/10.4103/1673-5374.244793
5. Datan E, Shirazian A, Benjamin S, Matassov D, Tinari A, Malorni W, et al. MTOR/p70S6K signaling distinguishes routine, maintenance-level autophagy from autophagic cell death during influenza A infection. Virology 2014; 452-3: 175-90. https://doi.org/10.1016/j.virol.2014.01.008
6. Feizi N, Mehrbod P, Romani B, Soleimanjahi H, Bamdad T, Feizi A, et al. Autophagy induction regulates influenza virus replication in a time-dependent manner. J Med Microbiol 2017; 66(4): 536-41. https://doi. org/10.1099/jmm.0.000455
7. Ham SY, Kwon T, Bak Y, Yu JH, Hong J, Lee SK, et al. Mucin 1-mediated chemo-resistance in lung cancer cells. Oncogenesis 2016; 5(1): e185. https://doi.org/10.1038/oncsis.2015.47
8. Nath S, Mukherjee P. MUC1: A multifaceted oncoprotein with a key role in cancer progression. Trends Mol Med 2014; 20(6): 332-42. https://doi.org/10.1016/j.molmed.2014.02.007
9. Kufe DW. MUC1-C oncoprotein as a target in breast cancer: Activation of signaling pathways and therapeutic approaches. Oncogene 2013; 32(9): 1073-81. https://doi.org/10.1038/onc.2012.158
10. McAuley JL, Gilbertson BP, Trifkovic S, Brown LE, McKimm-Breschkin JL. Influenza virus neuraminidase structure and functions. Front Microbiol 2019; 10. https://doi.org/10.3389/fmicb.2019.00039
11. Altschuler Y, Kinlough CL, Poland PA, Bruns JB, Apodaca G, Weisz OA, et al. Clathrin-mediated endocytosis of MUC1 is modulated by its glycosylation state. Mol Biol Cell 2000; 11(3): 819-31. https://doi.org/10.1091/ mbc.11.3.819
12. Kufe DW. Mucins in cancer: Function, prognosis and therapy. Vol. 9, Nature Reviews Cancer 2009. p. 874- 85. https://doi.org/10.1038/nrc2761
13. Mukhopadhyay P, Chakraborty S, Ponnusamy MP, Lakshmanan I, Jain M, Batra SK. Mucins in the pathogenesis of breast cancer: Implications in diagnosis, prognosis and therapy. Biochim Biophys Acta 2011; 1815(2): 224-40. https://doi.org/10.1016/j.bbcan.2011.01.001
14. Suh H, Pillai K, Morris DL. Mucins in pancreatic cancer: Biological role, implications in carcinogenesis and applications in diagnosis and therapy. Am J Cancer Res 2017; 7(6): 1372-83.
15. Schirm J, Luijt DS, Pastoor GW, Mandema JM, Schröder FP. Rapid detection of respiratory viruses using mixtures of monoclonal antibodies on shell vial cultures. J Med Virol 1992; 38(2): 147-51. https://doi. org/10.1002/jmv.1890380214
16. Donis RO, Ziegler T, Chen LM, Davis CT, Foust A, Hossain MJ, et al. Performance characteristics of qualified cell lines for isolation and propagation of influenza viruses for vaccine manufacturing. Vaccine 2014; 32(48): 6583. https://doi.org/10.1016/j.vaccine.2014.06.045
17. Zheng J, Wei S, Xiao T, Li G. LC3B/p62-mediated mitophagy protects A549 cells from resveratrol-induced apoptosis. Life Sciences 2021; 119139. https://doi.org/10.1016/j.lfs.2021.119139
18. The Human Protein Atlas. MUC1 protein expression summary. Available from: https://www.proteinatlas. org/ENSG00000185499-MUC1 (Accessed date: 26.09.2022).
19. Rajabi H, Hiraki M, Kufe D. MUC1-C activates polycomb repressive complexes and downregulates tumor suppressor genes in human cancer cells. Oncogene 2018; 37(16): 2079-88. https://doi.org/10.1038/ s41388-017-0096-9
20. Kuss-Duerkop SK, Wang J, Mena I, White K, Metreveli G, Sakthivel R, et al. Influenza virus differentially activates mTORC1 and mTORC2 signaling to maximize late stage replication. PLoS pathogens 2017; 13(9): e1006635. https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1006635
21. Kremer TM, Rinne ML, Xu Y, Chen XM, Kelley MR. Protection of pulmonary epithelial cells from oxidative stress by hMYH adenine glycosylase. Respir Res 2004; 5(1): 16. https://doi.org/10.1186/1465-9921-5- 16
22. Čikoš Š, Bukovská A, Koppel J. Relative quantification of mRNA: Comparison of methods currently used for real-time PCR data analysis. BMC Mol Biol 2007; 8: 113. https://doi.org/10.1186/1471-2199-8-113

APA	Özkan H, Özarslan M, Vatansever G, Durmaz S, Cicek C (2023). Kanser Kökenli Hücre Dizilerinde İnfluenza Virüsünün İndüklediği Otofaji Belirteçleri ile MUC1 Ekspresyonu Arasındaki İlişkinin Araştırılması. , 390 - 400. 10.5578/mb.20239932
Chicago	Özkan Hasan Selçuk,Özarslan Muhammed Alper,Vatansever Gokhan,Durmaz Seyfi,Cicek Candan Kanser Kökenli Hücre Dizilerinde İnfluenza Virüsünün İndüklediği Otofaji Belirteçleri ile MUC1 Ekspresyonu Arasındaki İlişkinin Araştırılması. (2023): 390 - 400. 10.5578/mb.20239932
MLA	Özkan Hasan Selçuk,Özarslan Muhammed Alper,Vatansever Gokhan,Durmaz Seyfi,Cicek Candan Kanser Kökenli Hücre Dizilerinde İnfluenza Virüsünün İndüklediği Otofaji Belirteçleri ile MUC1 Ekspresyonu Arasındaki İlişkinin Araştırılması. , 2023, ss.390 - 400. 10.5578/mb.20239932
AMA	Özkan H,Özarslan M,Vatansever G,Durmaz S,Cicek C Kanser Kökenli Hücre Dizilerinde İnfluenza Virüsünün İndüklediği Otofaji Belirteçleri ile MUC1 Ekspresyonu Arasındaki İlişkinin Araştırılması. . 2023; 390 - 400. 10.5578/mb.20239932
Vancouver	Özkan H,Özarslan M,Vatansever G,Durmaz S,Cicek C Kanser Kökenli Hücre Dizilerinde İnfluenza Virüsünün İndüklediği Otofaji Belirteçleri ile MUC1 Ekspresyonu Arasındaki İlişkinin Araştırılması. . 2023; 390 - 400. 10.5578/mb.20239932
IEEE	Özkan H,Özarslan M,Vatansever G,Durmaz S,Cicek C "Kanser Kökenli Hücre Dizilerinde İnfluenza Virüsünün İndüklediği Otofaji Belirteçleri ile MUC1 Ekspresyonu Arasındaki İlişkinin Araştırılması." , ss.390 - 400, 2023. 10.5578/mb.20239932
ISNAD	Özkan, Hasan Selçuk vd. "Kanser Kökenli Hücre Dizilerinde İnfluenza Virüsünün İndüklediği Otofaji Belirteçleri ile MUC1 Ekspresyonu Arasındaki İlişkinin Araştırılması". (2023), 390-400. https://doi.org/10.5578/mb.20239932

APA	Özkan H, Özarslan M, Vatansever G, Durmaz S, Cicek C (2023). Kanser Kökenli Hücre Dizilerinde İnfluenza Virüsünün İndüklediği Otofaji Belirteçleri ile MUC1 Ekspresyonu Arasındaki İlişkinin Araştırılması. Mikrobiyoloji Bülteni, 57(3), 390 - 400. 10.5578/mb.20239932
Chicago	Özkan Hasan Selçuk,Özarslan Muhammed Alper,Vatansever Gokhan,Durmaz Seyfi,Cicek Candan Kanser Kökenli Hücre Dizilerinde İnfluenza Virüsünün İndüklediği Otofaji Belirteçleri ile MUC1 Ekspresyonu Arasındaki İlişkinin Araştırılması. Mikrobiyoloji Bülteni 57, no.3 (2023): 390 - 400. 10.5578/mb.20239932
MLA	Özkan Hasan Selçuk,Özarslan Muhammed Alper,Vatansever Gokhan,Durmaz Seyfi,Cicek Candan Kanser Kökenli Hücre Dizilerinde İnfluenza Virüsünün İndüklediği Otofaji Belirteçleri ile MUC1 Ekspresyonu Arasındaki İlişkinin Araştırılması. Mikrobiyoloji Bülteni, vol.57, no.3, 2023, ss.390 - 400. 10.5578/mb.20239932
AMA	Özkan H,Özarslan M,Vatansever G,Durmaz S,Cicek C Kanser Kökenli Hücre Dizilerinde İnfluenza Virüsünün İndüklediği Otofaji Belirteçleri ile MUC1 Ekspresyonu Arasındaki İlişkinin Araştırılması. Mikrobiyoloji Bülteni. 2023; 57(3): 390 - 400. 10.5578/mb.20239932
Vancouver	Özkan H,Özarslan M,Vatansever G,Durmaz S,Cicek C Kanser Kökenli Hücre Dizilerinde İnfluenza Virüsünün İndüklediği Otofaji Belirteçleri ile MUC1 Ekspresyonu Arasındaki İlişkinin Araştırılması. Mikrobiyoloji Bülteni. 2023; 57(3): 390 - 400. 10.5578/mb.20239932
IEEE	Özkan H,Özarslan M,Vatansever G,Durmaz S,Cicek C "Kanser Kökenli Hücre Dizilerinde İnfluenza Virüsünün İndüklediği Otofaji Belirteçleri ile MUC1 Ekspresyonu Arasındaki İlişkinin Araştırılması." Mikrobiyoloji Bülteni, 57, ss.390 - 400, 2023. 10.5578/mb.20239932
ISNAD	Özkan, Hasan Selçuk vd. "Kanser Kökenli Hücre Dizilerinde İnfluenza Virüsünün İndüklediği Otofaji Belirteçleri ile MUC1 Ekspresyonu Arasındaki İlişkinin Araştırılması". Mikrobiyoloji Bülteni 57/3 (2023), 390-400. https://doi.org/10.5578/mb.20239932