Türkiye’den Bildirilen Sars-CoV-2 İzolatlarındaRT-PCR Primer/Prob Bağlanma BölgelerindekiNükleotit Değişimlerinin Analizi

BULGURCU, ALIHAN; SAYINER, Ayça Arzu; Appak, Ozgur; Demir, Ayse Banu

doi:10.5578/mb.20219803

Türkiye’den Bildirilen Sars-CoV-2 İzolatlarındaRT-PCR Primer/Prob Bağlanma BölgelerindekiNükleotit Değişimlerinin Analizi

Ayşe Banu DEMİR, (İzmir Ekonomi Üniversitesi, Tıp Fakültesi, Tıbbi Biyoloji Anabilim Dalı, İzmir, Türkiye)

Alihan BULGURCU, (Dokuz Eylül Üniversitesi, Sağlık Bilimleri Enstitüsü, Mikrobiyoloji ve Klinik Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, İzmir, Türkiye)

Özgür APPAK, (Dokuz Eylül Üniversitesi, Tıp Fakültesi, Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, İzmir, Türkiye)

Ayça Arzu SAYINER (Dokuz Eylül Üniversitesi, Tıp Fakültesi, Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, İzmir, Türkiye)

Mikrobiyoloji Bülteni

2 0

Yıl: 2021 Cilt: 55 Sayı: 3 Sayfa Aralığı: 311 - 326 Metin Dili: Türkçe DOI: 10.5578/mb.20219803 İndeks Tarihi: 28-09-2021

Türkiye’den Bildirilen Sars-CoV-2 İzolatlarındaRT-PCR Primer/Prob Bağlanma BölgelerindekiNükleotit Değişimlerinin Analizi

Öz:

COVID-19 salgınına neden olan SARS-CoV-2 virüsü, dünya genelinde 55 milyondan fazla olguya ve 1.5 milyona yakın ölüme neden olmuştur. Hastalığın mikrobiyolojik tanısında en geçerli yöntem, gerçek zamanlı revers transkriptaz polimeraz zincir reaksiyonu (rRT-PCR) ile viral genomun varlığının saptanmasıdır. Ancak RNA virüslerinin doğası gereği sıkça mutasyona uğramaları, PCR gibi virüsün genetik materyali üzerinde yapılan analizlerin duyarlılığını etkileyebilmektedir. Bu çalışmada, COVID-19 tanısında kullanılan rRT-PCR panellerinin primer-prob bağlanma bölgelerindeki mutasyonların araştırılması amaçlanmıştır. Türkiye’deki COVID-19 olgularından izole edilen ve 17 Mart-14 Eylül 2020 tarihleri arasında, İstanbul (n= 78), Ankara (n= 58), Kars (n= 47), Bursa (n= 2), Adıyaman (n= 2), Erciyes (n= 1) ve Kocaeli (n= 1)’de bulunan merkezlerden GISAID veri tabanına yüklenen 194 adet SARS-CoV-2 tüm genom sekans verileri incelenmiştir. Nükleotit değişimlerinin belirlenmesi için, Türkiye’deki SARS-CoV-2 sekansları, “GenBank” sitesinde bulunan referans genom sekansı (NC_045512.1) ile karşılaştırılmıştır. Oluşturulan veri seti MAFFT programı kullanılarak hizalanmış ve AliView programı kullanılarak, sekansların aynı çerçevede olduğu manuel olarak biçimlendirilerek kontrol edilmiştir. SARS-CoV-2 rRT-PCR tanısında kullanılmak üzere tanımlanmış, yedi farklı enstitüye ait (US CDC, China CDC, Charite CDC, Pasteur, HKU, Thailand, NIID) toplamda 13 adet PCR panelinin, primer-prob bağlanma bölgeleri, AliView programı ile belirlenmiş ve bu bölgelerdeki referans genoma göre değişiklik gösteren nükleotit değişimleri değerlendirilmiştir. Viral genomlardaki sekans çeşitliliği, pozisyonel nükleotit sayısal hesaplayıcı ve entropi hesaplayıcı modüller ile belirlenmiş ve her bir rRT-PCR paneli için, primer-prob bağlanma bölgelerindeki nükleotit ve entropi değişimleri incelenmiştir. On üç farklı primer-prob kombinasyonunun analizi sonucunda, yedi primerprob panelinin hedef bölgelerinde nükleotit değişimleri olduğu belirlenmiştir. Primer-prob bağlanma bölgelerinde nükleotit değişimleri bulunan viral sekanslar incelendiğinde, en sık rastlanan değişimlerin, “China CDC” N-ileri primer ve “US CDC” N3-ileri primer bağlanma bölgelerinde olduğu gözlemlenmiştir. Özellikle tanı testi olarak kullanılacak kitlerin, nükleotit değişimlerinin daha az olduğu bölgelere özgü tasarlanması önemlidir. Nükleotit değişimleri, PCR panellerinin çoğu için, DNA çoğalması açısından kritik olmayabilir ancak testin duyarlılığını etkileyebilme olasılığından ötürü dikkatle izlenmesi gerekmektedir. Tasarlanan bölgenin değişime uğrama riski fazla ise primer-prob bağlanma bölgelerinin sıklıkla kontrol edilmesi ve gerektiğinde güncellenmesi gerekmektedir.

Anahtar Kelime:

Analysis of Nucleotide Changes in RT-PCR Primer/Probe Binding Regions in SARS-CoV-2 Isolates Reported from Turkey

Öz:

The SARS-CoV-2 virus, which caused the COVID-19 epidemic, caused more than 55 million casesand nearly 1.5 million deaths worldwide. For the microbiological diagnosis of the disease, the most validmethod is detecting the presence of the viral genome by real-time reverse transcription polymerasechain reaction (rRT-PCR). However, due to the nature of the RNA viruses, frequent mutations may affectthe sensitivity of the analyses made on the genetic material of the virus, such as PCR. In this study, weaimed to investigate the mutations in the primer-probe binding regions of the rRT-PCR panels used inCOVID-19 diagnosis. SARS-CoV-2 whole genome sequence data (n= 194) isolated from COVID-19 casesin Turkey and uploaded on GISAID database from the centers in İstanbul (n= 78), Ankara (n= 58), Kars(n= 47), Bursa (n= 2), Adıyaman (n= 2), Erciyes (n= 1) and Kocaeli (n= 1) between March 17-September14, 2020 were analyzed. In order to determine the nucleotide changes, SARS-CoV-2 sequences from Tur key were compared to the reference genome sequence (NC_045512.1) present in “GenBank” website.The constructed data set was aligned using the MAFFT program and was checked manually if the sequ ences were in the same frame by using the AliView program. Primer-probe binding sites of the thirteenSARS-CoV-2 rRT-PCR panels from seven different institutes (US CDC, China CDC, Charite CDC, Pasteur,HKU, Thailand, NIID) that are being used in COVID-19 diagnosis were evaluated in terms of nucleotidechanges within the corresponding regions compared to the reference genome. Sequence diversities inthe viral genomes were determined via positional nucleotide numerical calculator and entropy calculatormodules and nucleotide and entropy changes in primer-probe binding regions for each rRT-PCR panelwere examined. Among thirteen different primer-probe panels, nucleotide changes in the target regionsof the seven primer-probe panels were determined. When viral sequences with nucleotide changes in theprimer-probe binding regions were examined, the most common changes were observed in the “ChinaCDC” N-forward primer and “US CDC” N3-forward primer binding regions. It is important that the kitsto be used as diagnostic tests are designed specific to the regions with less nucleotide changes. Nuc leotide changes may not be critical for DNA amplification for most PCR panels, but should be carefullymonitored as they may affect the sensitivity of the assay. If the risk of alteration of the designed regionis high, the primer - probe binding sites should be checked frequently and updated when necessary.

Anahtar Kelime:

Belge Türü: Makale Makale Türü: Diğer Erişim Türü: Bibliyografik

1. Cui J, Li F, Shi ZL. Origin and evolution of pathogenic coronaviruses. Nat Rev Microbiol 2019; 17(3): 181-92.
2. Gorbalenya AE, Baker SC, Baric RS, de Groot RJ, Drosten C, Gulyaeva AA, et al. The species Severe acute respiratory syndrome-related coronavirus: classifying 2019-nCoV and naming it SARS-CoV-2. Nat Microbiol 2020; 5(4): 536-44.
3. Chan JF, Kok K. Correction to: Genomic characterization of the 2019 novel human-pathogenic coronavirus isolated from a patient with atypical pneumonia after visiting Wuhan. Emerg Microbes Infect 2020; 9(1): 540.
4. Malik YS, Sircar S, Bhat S, Sharun K, Dhama K, Dadar M, et al. Emerging novel coronavirus (2019-nCoV)— current scenario, evolutionary perspective based on genome analysis and recent developments. Vet Q 2020; 40(1): 68-76.
5. Xu Y, Xiao M, Liu X, Xu S, Du T, Xu J, et al. Significance of serology testing to assist timely diagnosis of SARSCoV-2 infections: implication from a family cluster. Emerg Microbes Infect 2020; 9(1): 924-7.
6. World Health Organization (WHO). Laboratory testing for coronavirus disease (COVID-19) in suspected human cases. WHO 2020. Available from: https://www.who.int/publications/i/item/diagnostic-testing-forsars-cov-2
7. Centers for Disease Control and Prevention (CDC). CDC 2019-nCoV Real-Time RT-PCR Diagnostic Panel. Acceptable Alternative Primer and Probe Sets. CDC 2020. Available from: https://www.cdc.gov/ coronavirus/2019-ncov/downloads/List-of-Acceptable-Commercial-Primers-Probes.pdf
8. Mathuria JP, Yadav R, Rajkumar. Laboratory diagnosis of SARS-CoV-2 - A review of current methods. J Infect Public Health 2020; 13(7): 901-5.
9. Álvarez-Díaz DA, Franco-Muñoz C, Laiton-Donato K, Usme-Ciro JA, Franco-Sierra ND, Flórez-Sánchez AC, et al. Molecular analysis of several in-house rRT-PCR protocols for SARS-CoV-2 detection in the context of genetic variability of the virus in Colombia. Infect Genet Evol 2020; 84: 104390.
10. Pachetti M, Marini B, Benedetti F, Giudici F, Mauro E, Storici P, et al. Emerging SARS-CoV-2 mutation hot spots include a novel RNA-dependent-RNA polymerase variant. J Transl Med 2020; 18(1): 1-9.
11. Wang C, Liu Z, Chen Z, Huang X, Xu M, He T, et al. The establishment of reference sequence for SARS-CoV-2 and variation analysis. J Med Virol 2020; 92(6): 667-74.
12. Kim JS, Jang JH, Kim JM, Chung YS, Yoo CK, Han MG. Genome-wide identification and characterization of point mutations in the SARS-CoV-2 genome. Osong Public Heal Res Perspect 2020; 11(3): 101-11.
13. Callaway E. Making sense of coronavirus mutations. Nature 2020; 585(7824): 174-7.
14. Shu Y, McCauley J. GISAID: Global initiative on sharing all influenza data – from vision to reality. Euro Surveill 2017; 22(13): 2-4.
15. Elbe S, Buckland-Merrett G. Data, disease and diplomacy: GISAID’s innovative contribution to global health. Glob Chall 2017; 1(1): 33-46.
16. Peñarrubia L, Ruiz M, Porco R, Rao SN, Juanola-Falgarona M, Manissero D, et al. Multiple assays in a realtime RT-PCR SARS-CoV-2 panel can mitigate the risk of loss of sensitivity by new genomic variants during the COVID-19 outbreak. Int J Infect Dis 2020; 97: 225-9.
17. Chan JFW, Yip CCY, To KKW, Tang THC, Wong SCY, Leung KH, et al. Improved molecular diagnosis of COVID-19 by the novel, highly sensitive and specific COVID-19-rdrp/hel real-time reverse transcription-PCR assay validated in vitro and with clinical specimens. J Clin Microbiol 2020; 58(5): 1-10.
18. Vogels CBF, Brito AF, Wyllie AL, Fauver JR, Ott IM, Kalinich CC, et al. Analytical sensitivity and efficiency comparisons of SARS-CoV-2 RT–qPCR primer–probe sets. Nat Microbiol 2020; 5(10): 1299-305.
19. Wang R, Hozumi Y, Yin C, Wei GW. Mutations on COVID-19 diagnostic targets. Genomics 2020; 112(6): 5204-13.
20. Khan KA, Cheung P. Presence of mismatches between diagnostic PCR assays and coronavirus SARS-CoV-2 genome: Sequence mismatches in SARS-CoV-2 PCR. R Soc Open Sci 2020; 7(6): 200636.
21. Stadhouders R, Pas SD, Anber J, Voermans J, Mes THM, Schutten M. The effect of primer-template mismatches on the detection and quantification of nucleic acids using the 5′ nuclease assay. J Mol Diagnostics 2010; 12(1): 109-17.
22. Whiley DM, Sloots TP. Sequence variation in primer targets affects the accuracy of viral quantitative PCR. J Clin Virol 2005; 34(2): 104-7.
23. Lefever S, Pattyn F, Hellemans J, Vandesompele J. Single-nucleotide polymorphisms and other mismatches reduce performance of quantitative PCR assays. Clin Chem 2013; 59(10): 1470-80.
24. Armstrong PM, Prince N, Andreadis TG. Development of a multi-target TaqMan assay to detect eastern equine encephalitis virus variants in mosquitoes. Vector-Borne Zoonotic Dis 2012; 12(10): 872-6.
25. Brault AC, Fang Y, Dannen M, Anishchenko M, Reisen WK. A naturally occurring mutation within the probe-binding region compromises a molecular-based west nile virus surveillance assay for mosquito pools (Diptera: Culicidae). J Med Entomol 2012; 49(4): 939-41.
26. Bru D, Martin-Laurent F, Philippot L. Quantification of the detrimental effect of a single primer-template mismatch by real-time PCR using the 16S rRNA gene as an example. Appl Environ Microbiol 2008; 74(5): 1660-3.
27. Rejali NA, Moric E, Wittwer CT. The effect of single mismatches on primer extension. Clin Chem 2018; 64(5): 801-9.
28. Persson S, Karlsson M, Borsch-Reniers H, Ellström P, Eriksson R, Simonsson M. Missing the match might not cost you the game: primer-template mismatches studied in different hepatitis a virus variants. Food Environ Virol 2019; 11(3): 297-308.

APA	Demir A, BULGURCU A, Appak O, SAYINER A (2021). Türkiye’den Bildirilen Sars-CoV-2 İzolatlarındaRT-PCR Primer/Prob Bağlanma BölgelerindekiNükleotit Değişimlerinin Analizi. , 311 - 326. 10.5578/mb.20219803
Chicago	Demir Ayse Banu,BULGURCU ALIHAN,Appak Ozgur,SAYINER Ayça Arzu Türkiye’den Bildirilen Sars-CoV-2 İzolatlarındaRT-PCR Primer/Prob Bağlanma BölgelerindekiNükleotit Değişimlerinin Analizi. (2021): 311 - 326. 10.5578/mb.20219803
MLA	Demir Ayse Banu,BULGURCU ALIHAN,Appak Ozgur,SAYINER Ayça Arzu Türkiye’den Bildirilen Sars-CoV-2 İzolatlarındaRT-PCR Primer/Prob Bağlanma BölgelerindekiNükleotit Değişimlerinin Analizi. , 2021, ss.311 - 326. 10.5578/mb.20219803
AMA	Demir A,BULGURCU A,Appak O,SAYINER A Türkiye’den Bildirilen Sars-CoV-2 İzolatlarındaRT-PCR Primer/Prob Bağlanma BölgelerindekiNükleotit Değişimlerinin Analizi. . 2021; 311 - 326. 10.5578/mb.20219803
Vancouver	Demir A,BULGURCU A,Appak O,SAYINER A Türkiye’den Bildirilen Sars-CoV-2 İzolatlarındaRT-PCR Primer/Prob Bağlanma BölgelerindekiNükleotit Değişimlerinin Analizi. . 2021; 311 - 326. 10.5578/mb.20219803
IEEE	Demir A,BULGURCU A,Appak O,SAYINER A "Türkiye’den Bildirilen Sars-CoV-2 İzolatlarındaRT-PCR Primer/Prob Bağlanma BölgelerindekiNükleotit Değişimlerinin Analizi." , ss.311 - 326, 2021. 10.5578/mb.20219803
ISNAD	Demir, Ayse Banu vd. "Türkiye’den Bildirilen Sars-CoV-2 İzolatlarındaRT-PCR Primer/Prob Bağlanma BölgelerindekiNükleotit Değişimlerinin Analizi". (2021), 311-326. https://doi.org/10.5578/mb.20219803

APA	Demir A, BULGURCU A, Appak O, SAYINER A (2021). Türkiye’den Bildirilen Sars-CoV-2 İzolatlarındaRT-PCR Primer/Prob Bağlanma BölgelerindekiNükleotit Değişimlerinin Analizi. Mikrobiyoloji Bülteni, 55(3), 311 - 326. 10.5578/mb.20219803
Chicago	Demir Ayse Banu,BULGURCU ALIHAN,Appak Ozgur,SAYINER Ayça Arzu Türkiye’den Bildirilen Sars-CoV-2 İzolatlarındaRT-PCR Primer/Prob Bağlanma BölgelerindekiNükleotit Değişimlerinin Analizi. Mikrobiyoloji Bülteni 55, no.3 (2021): 311 - 326. 10.5578/mb.20219803
MLA	Demir Ayse Banu,BULGURCU ALIHAN,Appak Ozgur,SAYINER Ayça Arzu Türkiye’den Bildirilen Sars-CoV-2 İzolatlarındaRT-PCR Primer/Prob Bağlanma BölgelerindekiNükleotit Değişimlerinin Analizi. Mikrobiyoloji Bülteni, vol.55, no.3, 2021, ss.311 - 326. 10.5578/mb.20219803
AMA	Demir A,BULGURCU A,Appak O,SAYINER A Türkiye’den Bildirilen Sars-CoV-2 İzolatlarındaRT-PCR Primer/Prob Bağlanma BölgelerindekiNükleotit Değişimlerinin Analizi. Mikrobiyoloji Bülteni. 2021; 55(3): 311 - 326. 10.5578/mb.20219803
Vancouver	Demir A,BULGURCU A,Appak O,SAYINER A Türkiye’den Bildirilen Sars-CoV-2 İzolatlarındaRT-PCR Primer/Prob Bağlanma BölgelerindekiNükleotit Değişimlerinin Analizi. Mikrobiyoloji Bülteni. 2021; 55(3): 311 - 326. 10.5578/mb.20219803
IEEE	Demir A,BULGURCU A,Appak O,SAYINER A "Türkiye’den Bildirilen Sars-CoV-2 İzolatlarındaRT-PCR Primer/Prob Bağlanma BölgelerindekiNükleotit Değişimlerinin Analizi." Mikrobiyoloji Bülteni, 55, ss.311 - 326, 2021. 10.5578/mb.20219803
ISNAD	Demir, Ayse Banu vd. "Türkiye’den Bildirilen Sars-CoV-2 İzolatlarındaRT-PCR Primer/Prob Bağlanma BölgelerindekiNükleotit Değişimlerinin Analizi". Mikrobiyoloji Bülteni 55/3 (2021), 311-326. https://doi.org/10.5578/mb.20219803