Tek Basamaklı Ters Transkripsiyon Kantitatif PZRYönteminin miRNA Ekspresyon Analizleri içinOptimizasyonu

Süsgün, Seda; Yucesan, Emrah; Karacan, Ilker

doi:10.26650/experimed.2021.948146

Tek Basamaklı Ters Transkripsiyon Kantitatif PZRYönteminin miRNA Ekspresyon Analizleri içinOptimizasyonu

Seda SÜSGÜN, (Bezmialem Vakıf Üniversitesi, Tıp Fakültesi, Tıbbi Biyoloji Anabilim Dalı, İstanbul, Türkiye)

İlker KARACAN, (İstanbul Medeniyet Üniversitesi, Bilim ve İleri Teknoloji Uygulama ve Araştırma Merkezi, İstanbul, Türkiye)

Emrah YÜCESAN (Bezmialem Vakıf Üniversitesi, Tıp Fakültesi, Tıbbi Biyoloji Anabilim Dalı, İstanbul, Türkiye)

EXPERIMED

0 0

Yıl: 2021 Cilt: 11 Sayı: 2 Sayfa Aralığı: 113 - 119 Metin Dili: Türkçe DOI: 10.26650/experimed.2021.948146 İndeks Tarihi: 18-10-2021

Tek Basamaklı Ters Transkripsiyon Kantitatif PZRYönteminin miRNA Ekspresyon Analizleri içinOptimizasyonu

Öz:

Amaç: Bu çalışmada mikroRNA (miRNA) hedeflerinin spesifik olarak belirlenmesi ve ekspresyon ölçümünün yapılmasına yönelik tek basamaklı ters transkripsiyon kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (RT-qPZR) yönteminin, seçilen iki farklı miRNA (hsa-miR-145-5p ve hsa-miR-146a-5p) için araştırılması ve sürecin optimizasyonu amaçlanmıştır.Gereç ve Yöntem: RNA eldesi HEK293T hücre hattından yapılmıştır. Çalışmada seçilen her iki miRNA hedefi için uygun primerler tasarlanmış, tek basamaklı RT-qPZR yöntemi ile optimizasyon işlemi gerçekleştirilmiştir. Hedef amplikonların spesifiklik doğrulamaları agaroz jel elektroforezi ve konvansiyonel dizileme yöntemi ile gerçekleştirilmiştir. Bulgular: Tek basamakta gerçekleştirilen RT-qPZR çalışmasının her iki primer için de yüksek spesifiklikte ve hassasiyette sonuç verdiği qPZR erime eğrisi analizi ve agaroz jel görüntüleme sistemi ile gösterilmiştir. qPZR sırasındaki bağlanma sıcaklıklarından en düşük Ct değerinin 54°C’de elde edildiği görülmüştür. Ayrıca konvansiyonel Sanger dizileme sonucunda yalnızca ilgili miRNA dizilerinin hedeflendiği ve spesifik olmayan herhangi bir çoğaltma işleminin olmadığı gösterilmiştir.Sonuç: Sunulan çalışmada deneysel tasarım her iki miRNA hedefi için de optimize edilerek spesifik olarak yalnızca hedef miRNA molekülünün tespitinin yapılabildiği gösterilmiştir. Bu yaklaşım, ilerleyen çalışmalarda miRNA tespit ve ekspresyon analizlerinde güvenilir olarak kullanılabilecektir. Sunulan yaklaşım, düşük maliyetli, zamandan ve iş gücünden tasarruf sağlayan bir alternatif olması sebebiyle benzer tüm çalışmalarda değerlendirilebilir.

Anahtar Kelime:

Optimization of One Step Reverse Transcription Quantitative PCR Method for miRNA Expression Analyses

Öz:

Objective: We aimed to investigate and optimize the one step re verse transcription quantitative polymerase chain reaction (RT-qP CR) method for specific detection and quantitation of two selectedmicroRNA (miRNA)s, namely hsa-miR-145-5p and hsa-miR-146a-5p. Material and Method: RNA was extracted from HEK293T cellline. Primers were designed and experimentally optimized to becompatible with with one step RT-qPCR method for two select ed miRNAs. Targeted amplicons were visualized with agarosegel electrophoresis and sequenced using the Sanger methodfor specificity verification. Results: High specificity of one step RT-qPCR amplification wasdemonstrated using melt curve and agarose gel electrophoresisanalyses for both miRNA targets. It was shown that the earliestcycle threshold (Ct) values were obtained at the annealing tem perature of 54°C. Also, target specificity was confirmed by con ventional Sanger sequencing. Conclusion: In this study, one-step RT-qPCR design was optimizedfor both miRNA targets and target specificity was verified. Ourstudy showed this approach to be a good candidate for miRNAdetection and quantitation as a cost-effective alternative method.Furthermore, the approach is highly suitable for research projectsas it is both low-cost and fast, involving less hands-on time.

Anahtar Kelime:

Belge Türü: Makale Makale Türü: Diğer Erişim Türü: Erişime Açık

1. Lee RC, Feinbaum RL, Ambros V. The C. elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14. Cell. 1993; 75(5): 843-54. [CrossRef]
2. Vishnoi A, Rani S. MiRNA Biogenesis and Regulation of Diseases: An Overview. Methods Mol Biol. 2017; 1509: 1-10. [CrossRef]
3. Ha M, Kim VN. Regulation of microRNA biogenesis. Nat Rev Mol Cell Biol. 2014; 15(8): 509-24. [CrossRef]
4. Michlewski G, Caceres JF. Post-transcriptional control of miRNA biogenesis. RNA. 2019; 25(1): 1-16. [CrossRef]
5. Kozomara A, Birgaoanu M, Griffiths-Jones S. miRBase: from microRNA sequences to function. Nucleic Acids Res. 2019; 47(D1): D155-D62. [CrossRef]
6. Alles J, Fehlmann T, Fischer U, Backes C, Galata V, Minet M, et al. An estimate of the total number of true human miRNAs. Nucleic Acids Res. 2019; 47(7): 3353-64. [CrossRef]
7. Hydbring P, Badalian-Very G. Clinical applications of microRNAs. F1000Res. 2013; 2: 136. [CrossRef]
8. Yan J, Zhang N, Qi C, Liu X, Shangguan D. One-step real time RT-PCR for detection of microRNAs. Talanta. 2013; 110: 190-5. [CrossRef]
9. Androvic P, Valihrach L, Elling J, Sjoback R, Kubista M. Two-tailed RT-qPCR: a novel method for highly accurate miRNA quantification. Nucleic Acids Res. 2017; 45(15): e144. [CrossRef]
10. Tian T, Wang J, Zhou X. A review: microRNA detection methods. Org Biomol Chem. 2015; 13(8): 2226-38. [CrossRef]
11. Xie S, Zhu Q, Qu W, Xu Z, Liu X, Li X, et al. sRNAPrimerDB: comprehensive primer design and search web service for small non-coding RNAs. Bioinformatics. 2019; 35(9): 1566-72. [CrossRef]
12. Lu J, Getz G, Miska EA, Alvarez-Saavedra E, Lamb J, Peck D, et al. MicroRNA expression profiles classify human cancers. Nature. 2005 ;435(7043): 834-8. [CrossRef]
13. Huang Z, Shi J, Gao Y, Cui C, Zhang S, Li J, et al. HMDD v3.0: a database for experimentally supported human microRNA-disease associations. Nucleic Acids Res. 2019; 47(D1): D1013-D7. [CrossRef]
14. Chen C, Ridzon DA, Broomer AJ, Zhou Z, Lee DH, Nguyen JT, et al. Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR. Nucleic Acids Res. 2005; 33(20): e179. [CrossRef]
15. Saliminejad K, Khorram Khorshid HR, Soleymani Fard S, Ghaffari SH. An overview of microRNAs: Biology, functions, therapeutics, and analysis methods. J Cell Physiol. 2019; 234(5): 5451-65. [CrossRef]
16. Robinson S, Follo M, Haenel D, Mauler M, Stallmann D, Tewari M, et al. Droplet digital PCR as a novel detection method for quantifying microRNAs in acute myocardial infarction. Int J Cardiol. 2018; 257: 247-54. [CrossRef]
17. Li J, Yao B, Huang H, Wang Z, Sun C, Fan Y, et al. Real-time polymerase chain reaction microRNA detection based on enzymatic stem-loop probes ligation. Anal Chem. 2009; 81(13): 5446-51. [CrossRef]
18. Jin J, Vaud S, Zhelkovsky AM, Posfai J, McReynolds LA. Sensitive and specific miRNA detection method using SplintR Ligase. Nucleic Acids Res. 2016; 44(13): e116. [CrossRef]
19. Mei Q, Li X, Meng Y, Wu Z, Guo M, Zhao Y, et al. A facile and specific assay for quantifying microRNA by an optimized RT-qPCR approach. PLoS One. 2012; 7(10): e46890. [CrossRef]
20. Benes V, Collier P, Kordes C, Stolte J, Rausch T, Muckentaler MU, et al. Identification of cytokine-induced modulation of microRNA expression and secretion as measured by a novel microRNA specific qPCR assay. Sci Rep. 2015; 5: 11590. [CrossRef]
21. Munafo DB, Robb GB. Optimization of enzymatic reaction conditions for generating representative pools of cDNA from small RNA. RNA. 2010; 16(12): 2537-52. [CrossRef]
22. Raymond CK, Roberts BS, Garrett-Engele P, Lim LP, Johnson JM. Simple, quantitative primer-extension PCR assay for direct monitoring of microRNAs and short-interfering RNAs. RNA. 2005; 11(11): 1737-44. [CrossRef]
23. Sharbati-Tehrani S, Kutz-Lohroff B, Bergbauer R, Scholven J, Einspanier R. miR-Q: a novel quantitative RT-PCR approach for the expression profiling of small RNA molecules such as miRNAs in a complex sample. BMC Mol Biol. 2008; 9:34. [CrossRef]
24. Benes V, Castoldi M. Expression profiling of microRNA using real-time quantitative PCR, how to use it and what is available. Methods. 2010; 50(4): 244-9. [CrossRef]
25. Rai P, Kumar BK, Deekshit VK, Karunasagar I, Karunasagar I. Detection technologies and recent developments in the diagnosis of COVID-19 infection. Appl Microbiol Biotechnol. 2021; 105(2): 441- 55. [CrossRef]
26. Wang J, Cai K, Zhang R, He X, Shen X, Liu J, et al. Novel One-Step Single-Tube Nested Quantitative Real-Time PCR Assay for Highly Sensitive Detection of SARS-CoV-2. Anal Chem. 2020; 92(13): 9399-404. [CrossRef]

APA	Süsgün S, Karacan I, Yucesan E (2021). Tek Basamaklı Ters Transkripsiyon Kantitatif PZRYönteminin miRNA Ekspresyon Analizleri içinOptimizasyonu. , 113 - 119. 10.26650/experimed.2021.948146
Chicago	Süsgün Seda,Karacan Ilker,Yucesan Emrah Tek Basamaklı Ters Transkripsiyon Kantitatif PZRYönteminin miRNA Ekspresyon Analizleri içinOptimizasyonu. (2021): 113 - 119. 10.26650/experimed.2021.948146
MLA	Süsgün Seda,Karacan Ilker,Yucesan Emrah Tek Basamaklı Ters Transkripsiyon Kantitatif PZRYönteminin miRNA Ekspresyon Analizleri içinOptimizasyonu. , 2021, ss.113 - 119. 10.26650/experimed.2021.948146
AMA	Süsgün S,Karacan I,Yucesan E Tek Basamaklı Ters Transkripsiyon Kantitatif PZRYönteminin miRNA Ekspresyon Analizleri içinOptimizasyonu. . 2021; 113 - 119. 10.26650/experimed.2021.948146
Vancouver	Süsgün S,Karacan I,Yucesan E Tek Basamaklı Ters Transkripsiyon Kantitatif PZRYönteminin miRNA Ekspresyon Analizleri içinOptimizasyonu. . 2021; 113 - 119. 10.26650/experimed.2021.948146
IEEE	Süsgün S,Karacan I,Yucesan E "Tek Basamaklı Ters Transkripsiyon Kantitatif PZRYönteminin miRNA Ekspresyon Analizleri içinOptimizasyonu." , ss.113 - 119, 2021. 10.26650/experimed.2021.948146
ISNAD	Süsgün, Seda vd. "Tek Basamaklı Ters Transkripsiyon Kantitatif PZRYönteminin miRNA Ekspresyon Analizleri içinOptimizasyonu". (2021), 113-119. https://doi.org/10.26650/experimed.2021.948146

APA	Süsgün S, Karacan I, Yucesan E (2021). Tek Basamaklı Ters Transkripsiyon Kantitatif PZRYönteminin miRNA Ekspresyon Analizleri içinOptimizasyonu. EXPERIMED, 11(2), 113 - 119. 10.26650/experimed.2021.948146
Chicago	Süsgün Seda,Karacan Ilker,Yucesan Emrah Tek Basamaklı Ters Transkripsiyon Kantitatif PZRYönteminin miRNA Ekspresyon Analizleri içinOptimizasyonu. EXPERIMED 11, no.2 (2021): 113 - 119. 10.26650/experimed.2021.948146
MLA	Süsgün Seda,Karacan Ilker,Yucesan Emrah Tek Basamaklı Ters Transkripsiyon Kantitatif PZRYönteminin miRNA Ekspresyon Analizleri içinOptimizasyonu. EXPERIMED, vol.11, no.2, 2021, ss.113 - 119. 10.26650/experimed.2021.948146
AMA	Süsgün S,Karacan I,Yucesan E Tek Basamaklı Ters Transkripsiyon Kantitatif PZRYönteminin miRNA Ekspresyon Analizleri içinOptimizasyonu. EXPERIMED. 2021; 11(2): 113 - 119. 10.26650/experimed.2021.948146
Vancouver	Süsgün S,Karacan I,Yucesan E Tek Basamaklı Ters Transkripsiyon Kantitatif PZRYönteminin miRNA Ekspresyon Analizleri içinOptimizasyonu. EXPERIMED. 2021; 11(2): 113 - 119. 10.26650/experimed.2021.948146
IEEE	Süsgün S,Karacan I,Yucesan E "Tek Basamaklı Ters Transkripsiyon Kantitatif PZRYönteminin miRNA Ekspresyon Analizleri içinOptimizasyonu." EXPERIMED, 11, ss.113 - 119, 2021. 10.26650/experimed.2021.948146
ISNAD	Süsgün, Seda vd. "Tek Basamaklı Ters Transkripsiyon Kantitatif PZRYönteminin miRNA Ekspresyon Analizleri içinOptimizasyonu". EXPERIMED 11/2 (2021), 113-119. https://doi.org/10.26650/experimed.2021.948146