Klinik Örneklerden Mycobacterium tuberculosis Saptanmasında Anyplex MTB/NTM Testinin Değerlendirilmesi

SARIBAS, Zeynep; ALP, ALPASLAN

doi:10.5578/mb.67783

Klinik Örneklerden Mycobacterium tuberculosis Saptanmasında Anyplex MTB/NTM Testinin Değerlendirilmesi

Alpaslan ALP, (Hacettepe Üniversitesi, Tıp Fakültesi, Tıbbi Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı, Ankara, Türkiye)

Zeynep SARIBAŞ (Hacettepe Üniversitesi, Tıp Fakültesi, Tıbbi Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı, Ankara, Türkiye)

Mikrobiyoloji Bülteni

57 0

Yıl: 2019 Cilt: 53 Sayı: 4 Sayfa Aralığı: 355 - 363 Metin Dili: Türkçe DOI: 10.5578/mb.67783 İndeks Tarihi: 16-11-2020

Klinik Örneklerden Mycobacterium tuberculosis Saptanmasında Anyplex MTB/NTM Testinin Değerlendirilmesi

Öz:

Klinik örneklerden Mycobacterium tuberculosis’in hızlı ve doğru bir şekilde saptanabilmesi, tüberkülozun etkin kontrolündeki en önemli basamaklardan biridir. Tüberkülozun erken ve doğru tanısı, tedavininmümkün olan en kısa süre içerisinde başlatılabilmesini sağlamaktadır. Altın standart kültür yöntemlerineek olarak, tüberkülozun erken tanısında hızlı sonuç veren moleküler yöntemlerin de tanı algoritmasınaeklenmesi gerekmektedir. Bu nedenle son yıllarda tüberkülozun rutin tanısının yapıldığı laboratuvarlardamoleküler yöntemler önemli bir basamak haline gelmiştir. Bu çalışmanın amacı, rutin moleküler tanı laboratuvarlarında klinik örneklerden M.tuberculosis saptanması amacıyla kullanılmakta olan Anyplex MTB/NTM testinin (Seegene, Güney Kore) hızlı tanıdaki etkinliğinin araştırılmasıdır. Çalışmada yanı sıra, yurtdışı kökenli ticari kitlere alternatif olabilecek yerli kitler üretebilmek amacıyla tasarlanmış olan primerlerinpolimeraz zincir reaksiyonu (PCR) yöntemiyle ön değerlendirilmesinin yapılması hedeflenmiştir. Çalışmaya toplam üç yıllık süre içerisinde, tüberküloz şüphesi bulunan hastalardan elde edilerek laboratuvaragönderilmiş olan 10.652 klinik örnek dahil edilmiştir. Tüm örnekler boyama sonrasında mikroskobik inceleme, kültür ve gerçek zamanlı PCR (Rt-PCR) yöntemleri kullanılarak test edilmiştir. Hasta örneklerinden hazırlanan yaymalar aside dirençli basil varlığı açısından, Kinyoun boyama yöntemi ile boyandıktansonra mikroskop ile incelenmiştir. Kültür amacıyla, örneklere N-asetil-L-sistein-sodyum hidroksit yöntemiile homojenizasyon-dekontaminasyon işlemi uygulanmış, MGIT (Mycobacteria Growth Indicator Tube)şişelerine (Becton Dickinson, ABD) ve Löwenstein-Jensen besiyerine ekim yapılmıştır. Rt-PCR yöntemi iseAnyplex MTB/NTM testi ile gerçekleştirilmiştir. Çalışmanın birinci aşamasında, tüberkülozun molekülertanısında kullanılan Anyplex MTB/NTM testinin etkinliği, altın standart kültür yöntemiyle karşılaştırılarakdeğerlendirilmiştir. Bu amaçla seçilen 100 kültür-pozitif örneğe laboratuvar içi tasarımlı PCR yöntemi uygulanmıştır. Toplam 10.652 örneğin 178 (%1.7)’inde kültürde M.tuberculosis üremesi saptanmıştır. Altınstandart kültür yöntemiyle yapılan karşılaştırma sonucunda Anyplex MTB/NTM testinin duyarlılık ve özgüllüğü akciğer kökenli örneklerde sırasıyla %84 ve %99, akciğer dışı örneklerde ise sırasıyla %74 ve %99olarak bulunmuştur. Çalışmanın ikinci aşamasında ise, kültür sonucu pozitif olan örneklere, laboratuvar içitasarımla oluşturulan primerlerin kullanıldığı PCR yöntemi uygulanarak, ileriki çalışmalarda geliştirilmesi planlanan laboratuvar yapımı tüberküloz tanı kitinde kullanımının uygun olup olmadığı araştırılmıştır. Buamaçla seçilen 100 kültür pozitif örneğe laboratuvar içi tasarımlı PCR yöntemi uygulanmıştır. Bu örneklerin 98’inde kültür ile uyumlu pozitif sonuç elde edilirken, iki örnekte M.tuberculosis DNA’sı saptanmamıştır. Çalışma sonucunda Anyplex MTB/NTM testinin rutin tüberküloz tanısında kullanılabilecek hızlı, pratikve güvenilir bir test olduğu sonucuna varılmıştır. Laboratuvar içi tasarıma sahip primerlerin kullanıldığıPCR yönteminin ön değerlendirme sonuçlarının rutinde kullanılan yöntemlerle uyumlu çıkması, daha uygun maliyetli yerli üretim tüberküloz moleküler tanı kitlerinin geliştirilmesine ışık tutacaktır. Böylece rutintanı laboratuvarlarında hızlı tanının, daha uygun maliyetle gerçekleştirilmesi mümkün olacaktır.

Anahtar Kelime:

Evaluation of Anyplex MTB/NTM Test for The Detection of Mycobacterium tuberculosis in Clinical Specimens

Öz:

One of the most important steps for the control of tuberculosis is rapid and accurate detection of Mycobacterium tuberculosis in clinical samples. The early and accurate diagnosis of tuberculosis allows the initiation of the effective treatment regimen as early as possible. However the early diagnosis of tuberculosis can be achieved by the integration of molecular methods into the diagnostic algorithm of tuberculosis together with the gold standard culture methods. For this reason, molecular methods have become valuable diagnostic tools in routine diagnostic laboratories in recent years. The aim of this study was to determine the diagnostic efficacy of Anyplex MTB/NTM test (Seegene, South Korea) used for the molecular diagnosis of tuberculosis in routine molecular diagnostic laboratories. In addition to this aim, a preliminary evaluation of in-house polymerase chain reaction (PCR) primers that was designed to produce a kit as an alternative against imported commercial kits was performed. Ten thousand six hundred fifthy two clinical specimens that were collected from suspected tuberculosis cases in three years were included in the study. All samples were tested by microscopic examination after staining, culture and real-time PCR (Rt-PCR) methods. The smears were examined by microscope after staining with Kinyoun method for the existence of acid resistant bacilli. For culture, following the N-acetyl-L-sistein-sodium hydroxide homogenization and decontamination procedure, the samples were inoculated into the MGIT (Mycobacteria Growth Indicator Tube) tubes (Becton Dickinson, USA). Rt-PCR method was performed by using Anyplex MTB/NTM test. In the first stage of the study, the performance of the Anyplex MTB/NTM test was compared with the gold standard culture method. M.tuberculosis was isolated in 178 specimens out of 10.652 (1.7%). After the comparison with the gold standard culture method, the sensitivity and specificity of Anyplex MTB/NTM test was found to be 84% and 99% respectively in pulmonary samples, and 74% and 99% respectively in extrapulmonary samples. In the second stage of the study, PCR method with laboratory designed primers was applied to 100 culture positive samples. The PCR results of 98 samples were found to be in agreement with the culture, while M.tuberculosis DNA was not detected in two samples. As a result of the study it was concluded that Anyplex MTB/NTM test is a rapid, practical and reliable method that can be used in routine tuberculosis diagnosis. The high agreement between PCR method using the laboratory-designed primers and the PCR method used in routine practice will lighten the way for the development of national tuberculosis molecular diagnostic kits with a relevant cost. In this way, it will be possible to perform rapid diagnosis in a more cost-effective manner in routine diagnosis laboratories.

Anahtar Kelime:

Belge Türü: Makale Makale Türü: Araştırma Makalesi Erişim Türü: Bibliyografik

1. Global tuberculosis report 2018. Geneva: World Health Organization, 2018.
2. Drobniewski F, Nikolayevskyy V, Maxeiner H, Balabanova Y, Casali N, Kontsevaya I, et al. Rapid diagnostics of tuberculosis and drug resistance in the industrialized world: clinical and public health benefits and barriers to implementation. BMC Medicine 2013;11:190.
3. Denkinger CM, Kik SV, Cirillo DM, Casenghi M, Shinnick T, Weyer K, et al. Defining the needs for next generation assays for tuberculosis. J Infect Dis 2015;211(Suppl 2):S29-38.
4. Nurwidya F, Handayani D, Burhan E, Yunus F. Molecular diagnosis of tuberculosis. Chonnam Med J 2018;54(1):1-9.
5. Forbes BA, Hall GS, Miller MB, Novak SM, Rowlinson MC, Salfinger M, et al. Practice guidelines for clinical microbiology laboratories: Mycobacteria. Clin Microbiol Rev 2018;31(2). pii: e00038-17.
6. Lim JH, Kim CK, Bae MH. Evaluation of the performance of two real-time PCR assays for detecting Mycobacterium species. J Clin Lab Anal 2019;33(1):e22645.
7. Mpanyane DM, Maguga-Phasha TNC, Mashinya F, Malinga LA. The diagnostic utility of Anyplex Plus MTB/ NTM cycle threshold for detection of Mycobacterium tuberculosis complex among new and retreatment cases from a referral hospital in Limpopo Province, South Africa. Biomed Biotechnol Res J 2017;1:141-6.
8. Yajko DM, Nassos PS, Sanders CA, Gonzalez PC, Reingold AL, Horsburgh Jr CR, et al. Comparison of four decontamination methods for recovery of Mycobacterium avium complex from stools. J Clin Microbiol1993;31:302-6.
9. Yu MC, Chen HY, Wu MH, Huang WL, Kuo YM, Yu FL, et al. Evaluation of the rapid MGIT TBc identification test for culture confirmation of Mycobacterium tuberculosis complex strain detection. J Clin Microbiol 2011;49:802-7.
10. Perry MD, White PL, Ruddy M. Potential for use of the Seegene Anyplex MTB/NTM real-time detection assay in a regional reference laboratory. J Clin Microbiol 2014;52(5):1708-10.
11. Parish T, Smith DA, Roberts G, Betts J, Stoker NG. The senX3-regX3 two-component regulatory system of Mycobacterium tuberculosis is required for virulence. Microbiology 2003;149(Pt 6):1423-35.
12. Rageade F, Picot N, Blanc-Michaud A, Chatellier S, Mirande C, Fortin E, et al. Performance of solid and liquid culture media for the detection of Mycobacterium tuberculosis in clinical materials: meta-analysis of recent studies. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 2014;33:867-70.
13. Auld SC, Kasmar AG, Dowdy DW, Mathema B, Gandhi NR, Churchyard GJ, et al. Research roadmap for tuberculosis transmission science: Where do we go from here and how will we know when we’re there? J Infect Dis 2017;216(Suppl 6):S662-68.
14. Harries AD, Kumar AMV. Challenges and progress with diagnosing pulmonary tuberculosis in low- and middle-income countries. Diagnostics (Basel) 2018;pii:E78.
15. Eddabra R, Benhassou HA. Rapid molecular assays for detection of tuberculosis. Pneumonia (Nathan) 2018;10:4.
16. Mbelele PM, Mohamed SY, Sauli E, Mpolya EA, Mfinanga SG, Addo KK, et al. Meta-narrative review of molecular methods for diagnosis and monitoring of multidrug-resistant tuberculosis treatment in adults. Int J Mycobacteriol 2018;7(4):299-309.
17. Akkerman OW, van der Werf TS, de Boer M, de Beer JL, Rahim Z, Rossen JW, et al. Comparison of 14 molecular assays for detection of Mycobacterium tuberculosis complex in bronchoalveolar lavage fluid. J Clin Microbiol 2013;51:3505-11.
18. Gürsoy NC, Yakupoğulları Y, Tekerekoğlu MS, Otlu B. Klinik örneklerde Mycobacterium tuberculosis’in saptanması ve rifampin direncinin tespitinde Xpert MTB/RIF testinin tanısal performansının değerlendirilmesi. Mikrobiyol Bul 2016;50(2):196-204.
19. Özkütük N, Sürücüoğlu S. Orta prevalanslı bölgede akciğer ve akciğer dışı tüberküloz tanısında Xpert MTB/ RIF testinin değerlendirilmesi. Mikrobiyol Bul 2014;48:223-32.
20. Igarashi Y, Chikamatsu K, Aono A, Yi L, Yamada H, Takaki A, et al. Laboratory evaluation of the Anyplex™ II MTB/MDR and MTB/XDR tests based on multiplex real-time PCR and melting-temperature analysis to identify Mycobacterium tuberculosis and drug resistance. Diagn Microbiol Infect Dis 2017;89:276-81.
21. Perez-Garciaa F, Ruiz-Serranoa MJ, Roa PL, Acosta F, Pérez-Lago L, García-De-Viedma D, et al. Diagnostic performance of Anyplex II MTB/MDR/XDR for detection of resistance to first and second line drugs in Mycobacterium tuberculosis. J Microbiol Methods 2017;139:74-8.
22. Glover RT, Kriakov J, Garforth SJ, Baughn AD, Jacobs Jr WR. Mycobacterium smegmatis phosphate-dependent gene expression in senX3-regX3 regulates the two-component regulatory system. J Bacteriol 2007;189:5495- 503.
23. Bretl DJ, Demetriadou C, Zahrt TC. Adaptation to environmental stimuli within the host: two-component signal transduction systems of Mycobacterium tuberculosis. Microbiol Mol Biol Rev 2011;75:566-82.
24. Sanjuan-Jimenez R, Toro-Peinado I, Bermudez P, Colmenero JD, Morata P. Comparative study of a real-time PCR assay targeting senX3-regX3 versus other molecular strategies commonly used in the diagnosis of tuberculosis. PLoS One 2015;10:e0143025.

APA	ALP A, SARIBAS Z (2019). Klinik Örneklerden Mycobacterium tuberculosis Saptanmasında Anyplex MTB/NTM Testinin Değerlendirilmesi. , 355 - 363. 10.5578/mb.67783
Chicago	ALP ALPASLAN,SARIBAS Zeynep Klinik Örneklerden Mycobacterium tuberculosis Saptanmasında Anyplex MTB/NTM Testinin Değerlendirilmesi. (2019): 355 - 363. 10.5578/mb.67783
MLA	ALP ALPASLAN,SARIBAS Zeynep Klinik Örneklerden Mycobacterium tuberculosis Saptanmasında Anyplex MTB/NTM Testinin Değerlendirilmesi. , 2019, ss.355 - 363. 10.5578/mb.67783
AMA	ALP A,SARIBAS Z Klinik Örneklerden Mycobacterium tuberculosis Saptanmasında Anyplex MTB/NTM Testinin Değerlendirilmesi. . 2019; 355 - 363. 10.5578/mb.67783
Vancouver	ALP A,SARIBAS Z Klinik Örneklerden Mycobacterium tuberculosis Saptanmasında Anyplex MTB/NTM Testinin Değerlendirilmesi. . 2019; 355 - 363. 10.5578/mb.67783
IEEE	ALP A,SARIBAS Z "Klinik Örneklerden Mycobacterium tuberculosis Saptanmasında Anyplex MTB/NTM Testinin Değerlendirilmesi." , ss.355 - 363, 2019. 10.5578/mb.67783
ISNAD	ALP, ALPASLAN - SARIBAS, Zeynep. "Klinik Örneklerden Mycobacterium tuberculosis Saptanmasında Anyplex MTB/NTM Testinin Değerlendirilmesi". (2019), 355-363. https://doi.org/10.5578/mb.67783

APA	ALP A, SARIBAS Z (2019). Klinik Örneklerden Mycobacterium tuberculosis Saptanmasında Anyplex MTB/NTM Testinin Değerlendirilmesi. Mikrobiyoloji Bülteni, 53(4), 355 - 363. 10.5578/mb.67783
Chicago	ALP ALPASLAN,SARIBAS Zeynep Klinik Örneklerden Mycobacterium tuberculosis Saptanmasında Anyplex MTB/NTM Testinin Değerlendirilmesi. Mikrobiyoloji Bülteni 53, no.4 (2019): 355 - 363. 10.5578/mb.67783
MLA	ALP ALPASLAN,SARIBAS Zeynep Klinik Örneklerden Mycobacterium tuberculosis Saptanmasında Anyplex MTB/NTM Testinin Değerlendirilmesi. Mikrobiyoloji Bülteni, vol.53, no.4, 2019, ss.355 - 363. 10.5578/mb.67783
AMA	ALP A,SARIBAS Z Klinik Örneklerden Mycobacterium tuberculosis Saptanmasında Anyplex MTB/NTM Testinin Değerlendirilmesi. Mikrobiyoloji Bülteni. 2019; 53(4): 355 - 363. 10.5578/mb.67783
Vancouver	ALP A,SARIBAS Z Klinik Örneklerden Mycobacterium tuberculosis Saptanmasında Anyplex MTB/NTM Testinin Değerlendirilmesi. Mikrobiyoloji Bülteni. 2019; 53(4): 355 - 363. 10.5578/mb.67783
IEEE	ALP A,SARIBAS Z "Klinik Örneklerden Mycobacterium tuberculosis Saptanmasında Anyplex MTB/NTM Testinin Değerlendirilmesi." Mikrobiyoloji Bülteni, 53, ss.355 - 363, 2019. 10.5578/mb.67783
ISNAD	ALP, ALPASLAN - SARIBAS, Zeynep. "Klinik Örneklerden Mycobacterium tuberculosis Saptanmasında Anyplex MTB/NTM Testinin Değerlendirilmesi". Mikrobiyoloji Bülteni 53/4 (2019), 355-363. https://doi.org/10.5578/mb.67783